Работа 65. Оценка биосинтетической функции ткани по соотношению рнк и днк к белку

Исследуемый материал: ткани крысы.

Реактивы: 0,3 М, 0,5 М, 0,6 М растворы HСlO_4; 0,6 М раствор КОН, биуретовый реактив (см. работу 59).

Оборудование: пробирки, пипетки, ФЭК, кюветы с длиной оптического пути 5 мм, спектрофотометр, кипящая водяная и ледяная бани, центрифуга, фильтровальная бумага, стеклянная палочка, пробки для пробирок с обратным холодильником.

ХОД РАБОТЫ. Определение проводят строго на холоде в центрифужных пробирках, ставя 4-5 параллельных проб.

К 0,1 мл гомогената добавляют 1,9 мл 0,3 М раствора HСlO₄. Для полноты осаждения кислотонерастворимой фракции пробирки на 15 мин помещают в лед. Затем центрифугируют при 3000 g 10-15 мин. Осадки дважды отмывают 0,2 М раствором HСlO₄. После последнего центрифугирования стенки пробирки тщательно подсушивают фильтровальной бумагой, чтобы избежать загрязнения фракции кислотонерастворимым материалом, имеющимся в надосадочной жидкости.

Осадки суспендируют, предварительно растерев стеклянной палочкой в 0,5 мл воды, затем добавляют при комнатной температуре 0,5 мл 0,6 М раствора КОН, суспензия при этом светлеет. Если осадок суспендировать непосредственно в 0,3 М растворе КОН, быстро образуется желатиноподобный осадок, который не растворяется даже после гидролиза в течение 1 ч при 37˚С. Через 1 ч инкубации при 37˚С пробирки переносят на лед для остановки гидролиза.

В каждую пробирку добавляют по 2 мл 0,6 М раствора HСlO₄ и оставляют на 15 мин на льду. Центрифугируют 10 мин при 3000 g. Надосадочную жидкость параллельных проб объединяют для определения содержания РНК и измеряют поглощение в ультрафиолетовом свете при 270 нм и 290 нм. Стенки пробирок тщательно подсушивают, так как в осадке в дальнейшем определяют ДНК.

D₂₇₀ – D₂₉₀

Количество РНК (мкг/мл надосадочной жидкости) = ––––––––––– • 10,5.

0,19

Подсушенные пробирки с осадками заливают 0,5 М раствором HСlO₄ по 3 мл на пробу. Гидролиз проводят с каплеуловителем (во избежание изменения объема) на кипящей водяной бане в течение 20 мин. Для расчета используют формулу:

D₂₇₀ – D₂₉₀

Количество ДНК (мкг/мл надосадочной жидкости) = ––––––––––– • 10,1.

0,19

Белок в ткани определяют биуретовым методом (см. работу 58). Соотношение РНК/белок и ДНК/белок оценивают в мкг/г ткани. Делают вывод о биосинтетической функции различных тканей.

Библиографический список

Основной

1. Березов, Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. - 3-е изд-е, перераб. и доп. - М.: Медицина, 1998.- 704 с.

2. Кнорре, Д.Г. Биологическая химия / Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина. -2-е изд-е, перераб. и доп. - М.: Высш.шк.,1998.- 479 с.

3. Кольман, Я. Наглядная биохимия / Я. Кольман, К.-Г. Рём – М.: Мир, 2000. – 469 с.

4. Марри, Р. Биохимия человека / Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В. Радуэлл. В 2-х т. Пер. с англ. - М.: Мир, 1993.

5. Николаев, А.Я. Биологическая химия: Учебник / А.Я. Николаев. – 3-е изд.. перераб. и доп. – М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2007. – 568 с.: ил.

6. Ленинджер, А. Основы биохимии / А. Ленинджер. В 3-х т.- М.: Мир, 1983.

7. Страйер, Л. Биохимия / Л. Страйер. В 3-х т. - М.: Мир, 1984.

8. Филиппович, Ю.Б. Основы биохимии / Ю.Б. Филиппович - 4-е изд-е, перераб. и доп. - М.: Изд-во “Агар”, 1999. - 512 с.

Дополнительной

9. Белки и пептиды: В 2-х т.- М.: Наука, 1995. – Т.1. – 448 с.

10. Воронков, М.Г. Химия. − М.: Аванта⁺,2000. − С.431.

11. Досон, Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Элиот, У. Элиот, К. Джонс. – М.: Мир, 1991. – 544 с.

12. Мецлер, Д. Биохимия / Д. Мецлер. В 3-х т. - М.: Мир, 1980.

13. Овчинников, Ю.В. Биоорганическая химия / Ю.В. Овчинников.– М.: Наука, 1987. – 815 с.

14. Попов, Е.М. Проблема белка: в 5 т. Т.1: Химическое строение белка /Е.М. Попов, П.Д. Решетов, В.М. Липкин, Л.И. Патрушев. – М.: Наука, 1995. – 496 с.

15. Попов, Е.М. Проблема белка: в 5 т. Т.2: Пространственное строение белка / Е.М. Попов, В.В. Демин, Е.Д. Шибанова. – М.: Наука, 1996. – 480 с.

16. Сингер, М. Гены и геномы / М. Сингер, П. Берг. - В 2-х т. Пер. с англ. - М.: Мир, 1998.

17. Степанов, В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков : Учеб. для биол. спец. вузов /Под ред. А.С. Спирина. – М.: Высш.шк., 1996. – 335 с.

18. Elliott, W., Elliott D.C. Biochemistry and Molecular Biology. Second edition / W. Elliott, D.C. Elliott. - Oxford : University Press, 2001. – 586 p.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Таблица 1. Множители и приставки, применяемые для обозначения кратных и дольных единиц

МНОЖИТЕЛЬ	ПРИСТАВКА	ОБОЗНАЧЕНИЕ ПРИСТАВКИ (русское)
10-18	атто	а
10-15	фемто	ф
10-12	пико	п
10-9	нано	н
10-6	микро	мк
10-3	милли	м
10-2	санти	с
10-1	деци	д
101	дека	да
102	гекто	г
103	кило	к
106	мега	М
109	гига	Г
1012	тера	Т
1015	пета	П
1018	экса	Э

Таблица 2. Некоторые показатели нормы основных клинико-биохимических исследований

ПОКАЗАТЕЛЬ	ЗНАЧЕНИЕ (единицы СИ)
Плазма (сыворотка крови)
Адреналин	1,91 – 2,46 нмоль/л
Аланинаминотрансфераза	1,91 - 2,46 нмоль/л
Аскорбиновая кислота	34,1 – 90,9 мкмоль/л
Аспартатаминотрансфераза	0,17 – 0,68 мккат/л
Аммиак	11 – 35 мкмоль/л
Аполипопротеин А1	0,81 – 1,84 г/л
Аполипопротеин В	0,46 – 1,74 г/л
Белок общий	64-83 г/л
Билирубин	5 – 21 мкмоль/л
Гликопротеиды общие	1,2 – 1,6 г/л
Глюкоза	4,1 – 5,9 ммоль/л
Гемоглобин (в крови): мужчины женщины	2,0 – 2,79 ммоль/л 1,86-2,48 ммоль/л
Желчные кислоты	0,73 – 5,63 мкмоль/л
Жирные кислоты, свободные	0,28 – 0,89 ммоль/л
Инсулин, свободный	< 17 мЕ/л
Калий в сыворотке	3,6 – 5,1 ммоль/л
Калий в эритроцитах	79,4 – 112,6 ммоль/л
Кальций ионизированный в сыворотке	1,15 – 1,27 ммоль/л
Креатинин	0,044 – 0,088 ммоль/л
рН крови	7,35 – 7,45
Лактадегидрогеназа	0,8 – 4,0 ммоль/(ч*л)
Липиды общие	4,00 – 8,00 г/л
Липопротеины	3,50 – 7,50 г/л
Магний в сыворотке	0,66 – 1,07 ммоль/л
Молочная кислота в венозной крови	0,56 – 1,67 ммоль/л
Молочная кислота в артериальной крови	0,33 – 0,78 ммоль/л
Мочевина	2,50 – 8,33 ммоль/л
Мочевая кислота	0,12 – 0,24 ммоль/л
Натрий в сыворотке	136 – 145 ммоль/л
Натрий в эритроцитах	12,5 – 21,7 ммоль/л
Пировиноградная кислота	45,6 – 114 мкмоль/л
Сиаловые кислоты	2,0 – 2,36 мкмоль/л
Триацилглицериды	0,45 – 1.82 ммоль/л
Фибриноген	2,0 – 4,0 г/л
Фосфатаза кислая	0,05 – 0,13 мкмоль/(ч*л)
Фосфатаза щелочная	0,5 – 1,3 мкмоль/(ч*л)
Фосфолипиды общие	2,52 – 2,91 ммоль/л
Хлор (хлорид-ионы)	96 – 108 ммоль/л
Холестерин	0,78 – 1,63 ммоль/л

Титова Надежда Митрофановна, Замай Татьяна Николаевна, Боровкова Галина Ивановна

Биологическая химия

Редактор И.А. Вейсиг

Корректор Т.Е. Бистрыгина

Подписано в печать 200 г. Формат 60 84/16

108