3.2.4. Определение изоэлектрической точки белков

Изоэлектрической точкой белка называется определенная величина рН среды, при которой белок находится в виде нейтральных молекул (в изоэлектрическом состоянии), несущих равные количества положительных и отрицательных зарядов. При других концентрациях ионов водорода в растворе имеются преимущественно положительные и отрицательные ионы белка. Растворы белков в изоэлектрической точке наименее устойчивы и легко выпадают в осадок. Для большинства белков изоэлектрическая точка близка к нейтральной среде, но не вполне совпадает с ней, для многих белков она сдвинута в кислую сторону, а некоторые белки имеют изоэлектрическую точку при слабощелочной реакции среды. Определение изоэлектрической точки может быть сведено к определению рН раствора, при котором наблюдается наиболее быстрое и полное выпадение белка в осадок.

Работа 24. Определение изоэлектрической точки казеина

Исследуемый материал: молоко.

Реактивы: 10%-ная СН₃СООН, дистиллированная вода, 0,2 М раствор СН₃СOONa, 0,2 M раствор СН₃СООН.

Оборудование: пробирки, воронка, фильтры, стеклянная палочка.

ХОД РАБОТЫ

1. Выделение казеина из молока. К 2 мл молока добавляют 2 мл дистиллированной воды и 2 капли 10%-ной уксусной кислоты. Образуется осадок казеина, который отфильтровывают. Фильтрат отбрасывают, а осадок казеина осторожно снимают с фильтра стеклянной палочкой и помещают в чистые пробирки.

2. Определение изоэлектрической точки казеина. Для определения изоэлектрической точки казеина в 7 сухих пробирок наливают нужные реактивы в количествах, указанных в таблице. При смешивании растворов в каждой пробирке устанавливается определенная концентрация ионов водорода. Содержимое пробирок хорошо перемешивают. Через 5-10 мин во всех пробирках появляется осадок (помутнение). Наибольшее количество осадка наблюдается в той пробирке, рН которой соответствует изоэлектрической точке данного белка.

Оформление. Результаты опытов представить в таблице. В графе «Степень помутнения» отсутствие осадка обозначить знаком минус (-), наличие его – знаком плюс (+), значительное помутнение – несколькими плюсами.

Контрольные вопросы

1. Как ведут себя аминокислоты и белки в водном растворе и в присутствии избытка кислоты и щелочи?

2. От чего зависит заряд белка в водном растворе?

3. От чего зависит растворимость белка? Какие факторы стабилизируют белок в растворе?

4. Каковы общие механизмы осаждения белка из раствора? Какими способами можно осадить белок, не вызывая его денатурацию?

5. Что такое изоэлектрическая точка и как ее определить?

6. Что такое высаливание белка?

7. Что такое денатурация белка? Какие агенты, денатурирующие белки, вам известны?

8. В чем заключается разница между осаждением и денатурацией?

9. Каким образом можно разделить альбумины и глобулины сыворотки крови?

10. Назовите мероприятия при отравлении человека солями тяжелых металлов, основанные на необратимых реакциях осаждения белка.